Az olasz tenor 1921-ben született Motta Sant' Anastasiában, Szicíliában. Bár hatéves korában Milánóba költöztek, szülőföldjének dalaiból több lemezt is kiadott.
Tehetségére egy győztes kártyaparti után figyeltek fel 16 éves korában. dD Stefano örömében dalra fakadt, ennek hallatán egy barátja azonnal énektanárhoz küldte. Mesterei Adriano Tocchio, Luigi Montesanto és Mariano Stabile voltak.
A háború alatt természetesen őt is besorozták a seregbe, de egy felettese olyan csapnivaló katonának tartotta, hogy inkább átirányította a táborokat járó haknitársulatba, ahol Nino Florio művésznéven szórakoztatta társait. A háború után Svájcba szökött, első felvételeit Lausanne-ban, a rádió stúdiójában készítette.
Karrierje 1946-ban Reggio Emiliában kezdődött, ahol Jules Massenet Manonjában debütált Des Grieux-ként, majd ebben a szerepben lépett fel először a milánói Scalában is. A New York-i Metropolitanbe a Rigoletto Hercege volt a belépője 1948-ban, míg a brit közönség először Edinburgh-ben a fesztiválon láthatta a Szerelmi bájitalban. A Covent Gardenben keveset szerepelt, az Angol Királyi Operában mindössze 1961-ben és 1963-ban játszotta Cavaradossit, illetve a Bohémélet Rodolfóját. Utóbbi előadás azonban nem miatta, hanem a helyére beugró, akkor még ismeretlen Luciano Pavarotti miatt híresült el.
Di Stefanóra emlékezve megkerülhetetlen Maria Callas, akivel először 1951-ben léptek fel Sao Paolóban egy Traviata-előadásban. Ezt mexikóvárosi kitérővel követte a Scala, valamint a sokak számára ma is etalonnak számító 1953-as Tosca-felvétel. Emellett a Herbert von Karajan vezényelte Lammermoori Lucia (1955, Berlin) és a Luchino Visconti dirigálta Traviata (Scala,1955) rögzítette kettősüket. A két énekes a '70-es évekig több közös koncertet is adott, a korabeli bulvármagazinok cikkei pedig magánéleti összefonódásokról is szóltak.
Giuseppe di Stefano, akinek kiváló hangi adottságain túl vitalitását, sármját, őszinteségét és spontaneitását dicsérték a kritikusok, a nyolcvanas évek közepétől inkább rendezőként, és nem énekesként tevékenykedett, noha hivatalosan csak 1992-ben, Rómában vett búcsút a színpadtól.
2004-ben kenyai lakásukban ismeretlen tettesek támadták meg őt és feleségét, akik ki akarták őket rabolni. Di Stefano megpróbálta védeni feleségét, amikor egy súlyos tárggyal fejbe vágták. Kómába esett, és sérüléseit a műtétek ellenére nem heverte ki.
