Che Guevara az argentínai Rosarioban egy spanyol-ír származású családban 1928. május 14-én Ernesto Rafael Guevara de la Serna néven látta meg a napvilágot. Bár születési bizonyítványán hivatalos dátumként június 14-e szerepel, a valódi időpont május 14-e. A dátumváltoztatás hátterében az a törekvés állt, hogy elfedjék, anyja három hónapos terhesként kötött házasságot. A baloldali hagyományokkal rendelkező felső-középosztálybeli családban a szülőknek, Ernesto Guevara Lynch-nek és Celia de la Sernának Ernesto után még négy gyermeke született. Che gyermekkorát egy különösen nehéz típusú asztma nehezítette meg, végül mégis kiváló atlétaként tűnt ki kortársai közül.
1948-ban beiratkozott a Buenos Aires-i Egyetemre orvostanhallgatónak, ahol 1953-ban orvosként diplomázott. Szabadideje nagy részét utazásokkal töltötte Latin-Amerikában. 1951-ben idősebb barátjával, Alberto Granadoval, a radikális politikai nézetekkel rendelkező biokémikussal nagy utazást terveztek. La Poderosa nevű 500 köbcentis motorjukon indultak el a kontinens átszelésére Alta Graciaból. Guevara az utazást az "Egy motoros naplójá"-ban örökítette meg, melyet 1996-ban fordítottak le angolra, és most 2004-ben elkészült belőle a filmes verzió is.
Az utazás során látott tömeges szegénység megerősítette benne a hitet, hogy a latin-amerikai nyomor és kiszolgáltatottság felszámolása az egész kontinens jövőjének legmeghatározóbb momentuma lehet. Hamarosan Guatemalába utazott, ahol Jacobo Arbenz Guzmán szocialista kormányzata átfogó szociális reformok megvalósításán dolgozott. Az 1954-ben a CIA által pénzelt államcsínyben megbuktatott kormányzat sorsát látva Guevara csatlakozott az önkéntes ellenállókhoz, majd az argentin konzulátusra menekült. Innen azonban nem tudott visszatérni Argentinába, így életének következő helyszíne Mexikó lett.