Pedagógus-családból született, apja a helyi iskola igazgatója volt. Középiskoláit Sepsiszentgyörgyön végezte. 1898-1902 között az Eötvös Kollégium tagjaként a budapesti egyetem hallgatója, görög-latin szakos tanári és bölcsészdoktori oklevelet szerzett. Az egyetemi társai közül Révay Józsefet, Nyusztay Antalt és Földy Antal nevét érdemes megemlíteni. A tanárok közül Pecz Vilmos gyakorolta rá a legnagyobb hatást, Darkó mindig is a tanítványának vallotta magát. 1904-05-ben a müncheni egyetemen állami ösztöndíjas, 1905-07-ben az európai könyvtárak bizánci kéziratanyagát kutatta.
1902-03-ban Budapesten a gyakorló gimnázium tanára, az Eötvös Kollégiumban a görög nyelv a görög nyelv korrepetitora, az evangélikus gimnázium óraadó tanára. 1906-08 között a pápai református kollégium, majd a budapesti VII. kerületi állami gimnázium tanára. 1908-ban a debreceni Református Főiskolára nevezték ki tanárnak. 1910-től budapesti egyetem magántanárrá habilitálja közép- és újgörög filológiából. Értekezésének címe: A magyarokra vonatkozó népnevek a bizánci íróknál. 1914-től a debreceni egyetemen a klasszika-filológia nyilvános rendes tanára, 1918-19-ben és 1938-39-ben a bölcsészet-, nyelv- és történettudományi kar dékánja, 1928-29-ben az egyetem rektora. Erdély elcsatolása (1920) után sokat foglalkozott az erdélyi kérdés múltjával és jelenével. 1919-től a Székely Társaság, 1936-tól a debreceni Tisza István Tudományos Társaság elnöke volt.
Nagyon fiatalon, mindössze 33 évesen, 1913. április 24-én lett a Magyar Tudományos Akadémia levelező tagja. Ez az ugrás első pillantásra kissé nagynak tűnik, mivel addig csak folyóiratcikkei és egy terjedelmesebb munkája jelent meg. A későbbi működése azonban teljességgel igazolta az irányában megnyilvánult bizalmat. Bölcs Leó Taktikájának hitelessége magyar történeti szempontból című székfoglaló előadása 1914. május. 4-én hangzott el. Szívesen fordult a magyar vonatkozású bizantinológiai témákhoz. Alapvető tanulmányt írt a veszprémvölgyi apácák alapító-oklevelének hitelességéről, kiemelkedő értekezéseket szentelt a 13. századi magyar-bizáncsi kapcsolatoknak. Hozzászólt a Szent Korona bizánci részének eredetének kérdéséhez. A legnagyobb elismerést Laonikos Cholkokandylés szövegkiadással szerezte. A késő bizánci történelem legfontosabb történetírója elsőrendű forrást alkotott, amely a 15. századi eszmetörténet egyik legimpozánsabb emléke. Darkó végezte el az alapkutatásokat, ennek során 25 kézirat teljes vagy részleges összevetésére került sor.
A szöveg kritikai kiadása nagy szakmai elismertséggel járt együtt. 1930-ban és 1933-ban a Hariseion-alapítvány támogatásával Görögországban kutathatott. Tiszteletbeli doktora volt az athéni és a szófiai egyetemnek, 1936-tól az olasz Accademia degli Arcadi levelező tagja lett. Részt vett a belgrádi, az athéni, a szófiai és a római nemzetközi bizantinológiai kongresszuson s a magyarság képviseletében több bizottságnak tagja és egyes szakosztályok elnöke lett. 1925-től haláláig ő volt a Byzantinische Zeitschrift magyar referense.
Fő művei: A magyarokra vonatkozó népnevek a bizánci íróknál. Bp. 1910.; Bölcs Leó Taktikájának hitelessége magyar történeti szempontból. Bp., 1915.; Beszédek Erdélyért. Debrecen, 1919.; Laonici Chalcocondylae Historiarum demonstrationes. I-II. Kiad., bev. Bp., 1922-27.; Pecz Vilmos rendes tag emlékezete. Bp., 1925.; Byzantinisch-ungarische Beziehungen in der zweiten Hälfte des XIII. Jahrhunderts. Weimar, 1933.; Az ősmagyar hadművészet fejlődése és hatása Nyugateurópára. Bp.-Pécs, 1934.; A magyar huszárság eredete. Pécs, 1937.; A romániai magyar kisebbség kulturális helyzete. (Siculus álnéven.) Debrecen, 1938.; Népességi mozgalmak Erdélyben és környékén a középkorban. (Siculus álnéven.) Debrecen, 1938.; Die Landnahme der Ungarn und Siebenbürgen. - Die kulturelle Lage der ungarischen Minderheit in Rumänien. - Die rumänische Agrarreform und die ungarischen Kirchen. In: Die siebenbürgische Frage. Szerk. Lukinich Imre. Bp., 1940.; Die Übersiedlung der Walachen vom Süden nach Norden der Donai. Bulletin de la Société Historique Bulgare, 1940.
Róla szóló irodalom: Szabó Árpád: Darkó Jenő emlékezete. Debrecen, 1941.; Moravcsik Gyula: Darkó Jenő. Egyetemes Philológiai Közlöny, 1941.; Kapitánffy István: Darkó Jenő emlékezete. Antik Tanulmányok, 1980.; Kapitánffy István: Bibliographie der Publikationen von Jenő Darkó., Kádár Zoltán: Les resultats des recherches de Jenő Darkó sur les peuples nomad cavaliers., Kapitánffy István: Die byzantinologischen Arbeiten von Jenő Darkó., Szabó Kálmán: Jenő Darkó and Neo-Greek Philology. Acta Classica Universitatis Scientiarum Debreceniensis, 1981-82.
