Egy jómódú üzletember másodszülött fiaként látta meg a napvilágot. Apja küzdelme az alkohollal beárnyékolta gyermekkorát, viszonyuk még akkor is hűvös maradt, amikor már szárnyára kapta a világhír. Kiskorában gátlásos és visszahúzódó volt, részben diszlexiája miatt. Az iskolában tanítói olykor verték is, így csak tízéves korára tanult meg olvasni. Másik súlyos problémája egyenetlenül nőtt fogsora volt, híressé vált tökéletes mosolyát a hosszú évekig viselt fogszabályozónak köszönhette.
A középiskola után festészetet tanult, de csakhamar rádöbbent, hogy ebben a művészeti ágban nincs keresnivalója, annál inkább rabul ejtette a színjátszás. Álmainak megvalósítására várnia kellett, mert besorozták és Koreába küldték – az általa gyűlölt katonai szolgálatot úgy élte túl, hogy a sereget is színjátéknak fogta fel. Leszerelése után beiratkozott Lee Strasberg New York-i stúdiójába, de azon kevesek közé tartozott, akik rosszul érezték magukat ebben a híres műhelyben. Mint később elmondta, mindig nevethetnékje támadt, amikor látta, hogy évfolyamtársai mennyire komolyan veszik magukat. Végül Los Angelesben kötött ki, a színiiskola mellett pincérkedett és sofőrként dolgozott.
Kisebb szerepek után 1961-ben több tucat jelentkező közül őt választották ki a Dr. Kildare tévésorozat címszerepére, és szinte napok alatt világhírű lett; alakítását Golden Globe-díjjal ismerték el. Főként a fiatal lányok epedeztek érte, hetente 12 ezer szerelmes levelet kézbesített neki a posta, többet, mint Clark Gable-nek fénykorában. Gazdag volt, jóképű, sikeres, mindenhova fotósok hada kísérte, gyönyörű nők versengtek a kegyeiért. Szerencsés kiválasztottja egy Clara Ray nevű énekesnő volt – úgy hírlett, össze is házasodnak, ez azonban végül nem történt meg.
A sorozatból 1966-ban kiszállt, ezután a Broadway színpadain aratott sikereket. Kellemes hangjával is elkápráztatta rajongóit, popénekesként két album és számos kislemez fűződik a nevéhez. 1970-ben egy tévés talkshow kedvéért utazott Londonba, de öt évig maradt ott. Vérbeli angol színpadi színész vált belőle, klasszikus szerepek egész sorát kapta meg (Lear király, III. Richárd, Cyrano de Bergerac), Hamletként hatalmas sikert aratott. A szigetországban filmekben is szerepelt, Aramis ruháját vette magára A három testőrben Michael York, Oliver Reed és Raquel Welch partnereként, Csajkovszkijt formálta meg A zene szerelmeseiben Glenda Jackson oldalán.
Amerikába visszatérve jelentős film- és televíziós szerepek várták. A Pokoli torony című katasztrófafilmben egy felelőtlen építészt alakított, 1985-ben a Salamon király kincsében Sharon Stone-nal játszott együtt. Az igazán nagy sztárok közé a tévésorozatok révén jutott. Vonzó külsejének, intellektusának köszönhette A sógun címszerepét (amelyet azután kapott meg, hogy az eredetileg kiszemelt Sean Connery visszautasította a megkeresést), alakításáért Golden Globe-díjjal jutalmazták. A James Clavell regényéből készült sorozatban egy angol navigátort játszott, aki az 1600-as évek elején hajótörést szenved Japán partjainál, és tanúja, részese lesz a sógunátus kialakulásának, miközben ő is igazi japánná válik. Minden képzeletet felülmúló népszerűségét az 1983-ban készült Tövismadaraknak köszönheti, amely Magyarországon is milliókat szegezett a tévé képernyője elé. A szerelme és papi hivatása között őrlődő Ralph de Bricassart atya szerepének megformálásáért elnyerte harmadik Golden Globe-díját, és minden idők legszexisebb tévésztárjai közé választották. 1988-ban a Robert Ludlum regényéből készült tévésorozat, A Bourne-rejtély címszereplő szuperkémjét játszotta el. Bár a krimiszéria mérsékelt sikert aratott, őt hatodik alkalommal is Golden Globe-díjra nominálták.
Noha sokáig rebesgették, hogy a saját neméhez vonzódik, homoszexualitásáról először 2003-ban megjelent önéletrajzában beszélt nyilvánosan, amikor úgy érezte, kiöregedett a hősszerelmes szerepköréből, így vallomása már nem érinti hátrányosan pályafutását. 2017-ben a nagy sikerű Twin Peaks harmadik évadának egyik epizódjában vállalt szerepet, legutóbb 2019-ben állt kamera elé. A színész szabad idejében kedvenc időtöltésének, a festésnek hódol, és környezetvédelmi kérdésekkel foglalkozik.
Chamberlaint televíziós szerepeiért négy alkalommal jelölték Emmy-díjra, 1971-ben pedig egy Hamlet-felvételéért Grammy-díjra. 2000 óta csillaga díszíti a hollywoodi Hírességek sétányát. Tavaly beiktatták a Televíziós Hírességek Csarnokába.
