Eleonora Giulia Amalia Duse 1858. október 3-án született az akkor osztrák fennhatóság alatt álló, lombardiai Vigevanóban. Örmény eredetű színészcsaládból származott, vándorszínész szülei főleg vígjátékokkal járták Olaszországot. Eleonora négyévesen már Cosette-et alakította Victor Hugo Nyomorultak című regényének színpadi változatában, 12 évesen beugrott édesanyja helyett egy darabba, 15 évesen a Rómeó és Júlia főszerepét játszotta a veronai arénában.
21 évesen aratta első komoly sikereit a nápolyi Teatro dei Fiorentiniben az Othello Desdemonájaként és a Hamlet Opheliájaként. Nápolyban heves szerelmi viszonyba keveredett egy újságíróval, aki elhagyta, amikor várandós lett, gyermeke halva született. Duse 1880-ban férjhez ment egy pályatársához, 1882 januárjában lányuk született, de hamarosan elhidegültek, és 1885-ben elváltak.
Életében és pályafutásában a fordulópontot az jelentette, amikor Torinóban megnézte Sarah Bernhardt előadását. A világhírű francia színésznő színpadi temperamentuma annyira lenyűgözte, hogy megpróbált nyomdokaiba lépni, elsajátítani a biztos szövegtudáson alapuló drámai játékot. Sikerült kiharcolnia, hogy eljátszhassa Bernhardt sikerszerepét, a kaméliás hölgyet, és az 1883. január 10-i premieren francia vetélytársának túlzó gesztusai nélküli, egyszerűbb és modernebb szerepformálásával hatalmas sikert aratott. Ugyancsak ünnepelték Giovanni Verga Parasztbecsületében a fiatal parasztlány, Santuzza szerepében (Mascagni ebből a darabból írta később világsikert arató operáját). Nagy sikere volt Ibsen Nóra című darabjának olaszországi bemutatóján is.
Duse a kor színházi irányzatával szembemenve tudatosan finom arcjátékára és gesztusaira hagyatkozott, kerülte a mesterkélt intonálást, a deklamálást, a kellékeket és a sminket. Első külföldi turnéjára 1885-ben Dél-Amerikába indult, és bár anyanyelvén játszott, ahogy Rio de Janeiróban feljegyezte, meghódította „a kemény portugálhoz” szokott közönséget. A színésznő Egyiptomban, Spanyolországban, az Egyesült Államokban, Angliában, Bécsben, Berlinben, sőt még Szentpéterváron is vendégszerepelt, ahol Anton Csehov is lelkesedett érte. Magyarországon 1892 és 1907 között ötször lépett fel, többször is A kaméliás hölgy címszerepében.
1887-től a költő és zeneszerző Arrigo Boitóval folytatott viszonyt, aki Mefistofele című operája révén és Verdi librettistájaként lett ismert. Boito több Shakespeare-darabot fordított le számára. Carlo Goldoni A fogadósnő című komédiájában, Mirandolinaként látta meg a 28 éves színésznőt, akivel azonnal egymásba szerettek, de kapcsolatukat diszkréten kezelték, mert Boito attól tartott, arisztokrata barátai nem néznék jó szemmel, hogy egy színésznő a társa. Duse 1894-ben megismerkedett a nála öt évvel fiatalabb extravagáns költő és újságíró Gabriele D’Annunzióval, akivel nyilvánosan is felvállalt, viharos szerelmi kapcsolatba bonyolódtak. D’Annunzio négy színdarabot írt neki, és A tűz című regényében is megörökítette – a színésznőre nézve nem túl hízelgő módon – viszonyukat. Bár Duse egy vagyont költött D’Annunzio színműveinek népszerűsítésére, az író 1898-ban mégis nagy vetélytársára, Sarah Bernhardtra bízta Halott város című darabja főszerepét, a sértett Duse pedig véget vetett kapcsolatuknak. A rivális dívák vetélkedése megosztotta a művészetkedvelő közvéleményt – G. B. Shaw például, aki Londonban mindkettőjüket ugyanabban a darabban látta, Duse mellett foglalt állást.
Duse 1896-os amerikai turnéja valóságos diadalmenetnek bizonyult. Grover Cleveland elnök és felesége minden washingtoni előadására elment, sőt a first lady a Fehér Házban még teadélutánt is adott a díva tiszteletére, aki első színésznőként tehetett eleget ilyen meghívásnak. Az egyre gyengébb egészségű Duse 1909-ben egy berlini Ibsen-előadás után bejelentette, hogy visszavonul, a színpadra csak 1921-ben tért vissza. 1916-ban szerepelt a Hamu című félórás némafilmben, amelynek kópiái máig fennmaradtak, de a film csalódást okozott neki, egy levelében azt írta: abban szinte semmi sincs belőle. 1923. július 30-án Duse lett az első nő (és az első olasz), aki a nemrégiben indult Time magazin címlapján szerepelt. A következő évben öthetes amerikai körútra indult, de tüdőgyulladást kapott, amely végzetesnek bizonyult. A 65 éves színésznő egy pittsburgh-i előadásán összeesett, és két héttel később, 1924. április 21-én hotelszobájában elhunyt. A szerepeiben oly fenséges Duse magánéletében kerülte a nyilvánosságot, visszafogott és szerény volt, interjút ritkán adott, és egyszer azt mondta: „a színpadon kívül nem is létezem”.
Olaszországban számtalan színház és közterület viseli nevét, életét sokan megírták, színdarabokban, táncelőadásokban is feldolgozták. A színjátszás megújítójaként tartják számon, az ő előadó-művészetét tanulmányozva fejlesztette ki saját, világszerte oktatott módszerét az orosz színházi teoretikus, Konsztantyin Sztanyiszlavszkij.
