Egy Madridtól északra fekvő kisvárosban, Alcobendasban látta meg a napvilágot fodrász anya és autószerelő apa első lányaként, nevét Joan Manuel Serrat Penelope című daláról kapta. Húga, Mónica szintén színésznő lett, Eduardo öccse pedig énekes. Penélope kilenc évig klasszikus balettet tanult Madridban, és négy éven át színiórákat is vett. Tizenöt évesen látta Pedro Almodóvar Kötözz meg és ölelj! című filmjét; ekkor lett nagy álma, hogy színésznő lehessen, és együtt dolgozhasson a spanyol filmrendezővel.
A Mecano spanyol popzenekar több száz lány közül őt választotta ki a La Fuerza del Destino című klipje főszerepére, amely után egyenes út vezetett a televízió világába. 1990–91-ben egy kamaszoknak szóló televíziós talkshow-t vezetett, majd pár sorozatszerep után 18 évesen debütált a filmvásznon – főszerepet kapott a Sonka, sonka című szatírában (1992) és Fernando Trueba a legjobb külföldi film Oscar-díját elnyerő Belle époque (1992) című drámájában.
1993 és 1996 között tucatnyi olasz és spanyol filmben tűnt fel. Álma 1997-ben vált valóra, amikor Almodóvar kisebb szerepet osztott rá az Eleven hús című filmdrámában, egy évvel később ismét Trueba rendezte az Álomlányban, amelyért megkapta a spanyol Oscarnak nevezett Goya-díjat. Hollywood Almodóvar Mindent anyámról (1999) című, díjözönnel kitüntetett filmjében figyelt fel rá, ezután elhalmozták szerepajánlatokkal. Az első angol nyelvű filmjéért, az 1998-as Hi-Lo Country című westernért kapott fizetségét Teréz anya gyermekalapítványának ajánlotta fel.
Az ezredforduló elején olyan neves színészek mellett játszott, mint Matt Damon (Vad lovak), Nicolas Cage (Corelli kapitány mandolinja), Johnny Depp (Betépve) és Tom Cruise (Vanília égbolt). Utóbbi munkakapcsolatból szerelem szövődött, ez népszerűvé tette az amerikai közönség körében. A legkülönfélébb műfajokban bizonyította tehetségét: thrillerben (Gothika), kalandfilmben (Tulipános Fanfan, Szahara), romantikus drámában (Nézz az égre) és filmdrámában (Kromofóbia, Elégia) is szerepelt. A Las Bandidas című western-vígjátékban Hollywood másik latin sztárjával, Salma Hayekkel játszott. 2006-ban visszatért Almodóvarhoz a Volver kedvéért, amelyben egy vonzó, keményen dolgozó anyát játszott, aki lelkében súlyos múltbéli terhet cipel. Alakításáért megkapta második Goya-díját, az Európai Filmdíjat, valamint a film női csapatával megosztva Cannes-ban a legjobb női alakításnak járó elismerést. Emellett Cruz történelmet is írt, hiszen első spanyol színésznőként jelölték a legjobb női alakításért járó Oscar-díjra.
Az aranyszobrocska nem váratott sokáig magára, a 2009-es Oscar-díjátadón vehette át a Woody Allen rendezte Vicky Cristina Barcelona mellékszerepéért, s alakítását a Goya-díj mellett a brit filmakadémia BAFTA-díjával is elismerték. Ugyanabban az évben egy újabb Almodóvar-filmdrámát forgatott (Megtört ölelések), és Rob Marshall rendezésében Nicole Kidman, Marion Cotillard, Kate Hudson, Judi Dench és Sophia Loren oldalán szerepelt a Kilenc című, Fellini ihlette musicalben, amely harmadik Oscar-jelölését hozta el számára.
Ezt követően a közönség láthatta A Karib-tenger kalózai negyedik részében, a Rómának szeretettel című Woody Allen-filmben, a Gyilkosság az Orient expresszen-ben, az Escobarban, Aszhar Farhadi Oscar-díjas iráni rendező Mindenki tudja című filmdrámájában és Antonio Banderas partnereként a Fájdalom és dicsőségben. Almodóvarral közös legutóbbi filmjét, a Párhuzamos anyákat 2021-ben mutatták be a Velencei Nemzetközi Filmfesztiválon, ahol elnyerte a legjobb női alakítás díját, továbbá negyedszer is Oscarra jelölték.
Egyik legutóbbi szerepeként a Gianni Versace meggyilkolásáról szóló televíziós minisorozatban volt látható, s a neves divattervező húga, Donatella Versace megformálásáért Emmy-díjra jelölték, tavaly pedig a Ferrari című életrajzi drámában Adam Driver oldalán tűnt fel.
Cruzt, akinek – egyedüli spanyol színésznőként – 2011 óta csillaga van a hollywoodi Hírességek sétányán, 2018-ban César-életműdíjjal tüntették ki, és 2019-ben neki ítélték a San Sebastián-i Nemzetközi Filmfesztivál életműdíját, a Donostia-díjat. Nemzetközi hírneve és szépsége okán olyan márkák reklámoztak vele, mint a L’Oréal, a Lancôme, a Nintendo, a Coca-Cola vagy a Mango (utóbbi számára húgával ruhákat is terveztek). Cruz 2018 óta a Chanel arca, az üzletház idei reklámjában Brad Pitt-tel az Egy férfi és egy nő című filmklasszikust idézik meg.
A színésznő a szintén Oscar-díjas Javier Bardemmel az 1992-es Sonka, sonka forgatásán ismerkedett össze, a barátságból a Vicky Cristina Barcelona készítése alatt lett szerelem. A spanyol sztárpár 2010-ben kelt egybe, házasságukból két gyermek született. Érdekesség, hogy 2021-ben mindkettejüket Oscar-díjra jelölték; a filmtörténetben korábban nem fordult elő, hogy egy házaspár mindkét tagja ugyanabban az évben kapott volna jelölést a színészek közt.
