A Somogy vármegyei Csokonyán született 1825. október 5-én. Görög felmenői a 15. században telepedtek le Erdélyben, majd a Székelyföldről a Dunántúlra költöztek át. Apja, Xántus Ignác a Széchenyi család Somogy vármegyei birtokainak jogi ügyintézője, 1828-tól Somogy vármegye főügyésze volt. János a gimnázium első évét a győri bencéseknél végezte, majd Pécsre került a püspöki líceumba. Jogi stúdiumait Pécsett abszolválta, majd 1847-ben Pesten tett ügyvédi vizsgát. Az 1848-49-es forradalom és szabadságharc idején nemzetőrnek állt, harcolt a pákozdi csatában is. 1849 februárjában elfogták, a világosi fegyverletétel után büntetésként a császári hadseregbe sorozták, ahonnan az első adandó alkalommal megszökött. 1850-ben Londonba ment, de kilátástalan helyzete másfél év után tovább űzte Amerikába.
A hadsereg egyik nyugaton portyázó alakulatában szolgálva jutott el a Sziklás-hegységen túlra, később részt vett a transzkontinentális vasút nyomvonalának kijelölésében, az Arkansas folyó forrásvidékének feltérképezésében. Indiana állam területén topográfiai felméréseket végezve állat- és növénytani anyagot gyűjtött, majd meteorológiai megfigyeléseket végzett a Csendes-óceánon. John Xantus de Vesey néven Amerikában vált elismert természetrajzi gyűjtővé.
Családja 1856 elején Csokonyáról Győrbe költözött, ezért Xántus Amerikából ide küldte leveleit. Ezeket Prépost István hírlapíró – a szerző jóváhagyásával – kötetbe foglalta, és 1858 nyarán Levelek Éjszakamerikából címmel Pesten kiadta. 1858 őszére elkészült az Utazás Kalifornia déli részeiben című művének kézirata is, amely 1860 elején hagyta el a nyomdát. Műveinek Karl May (avagy May Károly) is lelkes olvasója volt, és a legenda szerint a német író levélben kérte Xántust, hogy róla mintázhassa Old Shatterhandot, Winnetou sápadtarcú barátját.
A regényben Old Shatterhand a készítőtől, Mr. Henrytől kapta a fegyver első példányát, úgyhogy nem zárható ki, hogy a karabély prototípusáról van szó. Az előagytáras ismétlőfegyvert a déliek „átkozott jenki puskának” hívták, mert „csak vasárnap töltötték meg, és egész héten lőttek vele”.
Xántust publikációi, állat- és növénytani gyűjtőmunkája elismeréséül a Magyar Tudományos Akadémia 1859 decemberében levelező tagjává választotta. Az önkényuralom enyhülése után, nemzeti hősnek kijáró tisztelettől övezve 1861-ben érkezett vissza Győrbe, ahol a vármegye a törvényhatósági bizottság tiszteletbeli tagjává választotta. A Győri Közlönyben megjelentek nyugat-mexikói utazásairól írott levelei.
1862-ben ismét New Yorkba utazott. Útjának egyes állomásairól színes tudósításokat küldött a győri lap számára Levelek külföldről címmel. 1862 decemberében kinevezték amerikai konzulnak Mexikó egyik kikötővárosába, Manzanillóba; állásából 1863 júliusában felmentették, ezután hajóbiztosítási ügynökként tevékenykedett.
Megromlott egészsége miatt Ótátrafüredre utazott gyógykezelésre, majd erdélyi körútján meglátogatta rokonait. Megírta A magyarországi gőzhajózás érdekében című értekezését, mely a Győri Közlönyben jelent meg négy részben. Barátaival egy új kaszinó létrehozásán fáradozott, és Győri Lapok címmel újságalapítás gondolata is foglalkoztatta, de a városi hatóság egyiket sem támogatta.
1865 őszén Pestre költözött, s 1866-ban kinevezték az állatkert (ma Fővárosi Állat- és Növénykert) első igazgatójának. 1868 végén Eötvös József kultuszminiszter támogatásával kelet-ázsiai gyűjtőútra indult, hazatérése után gazdag természettani és néprajzi anyaggal gyarapította a Magyar Nemzeti Múzeum gyűjteményét. 1872. március 5-én a Nemzeti Múzeum Ethnographiai (néprajzi) Osztálya igazgatóőrének nevezték ki, ennek emlékére ünnepeljük 2003 óta március 5-én a Néprajzi Múzeum napját.
Xántus alapító tagja, később alelnöke volt a Magyar Földrajzi Társaságnak, elnöke, majd tiszteletbeli elnöke a Magyar Néprajzi Társaságnak.
Xántus János elborult elmével, 1894. december 13-án hunyt el Budapesten. Hamvait a Kerepesi temetőben (Fiumei Úti Sírkertben) helyezték örök nyugalomra. 1951-ben Győrött múzeumot neveztek el róla, ma a város állatkertje is nevét viseli. Növény- és állatfajok tudományos elnevezésével is emléket állítottak neki. 2000 óta a nevét viselő budapesti két tanítási nyelvű gimnázium előtt áll mellszobra. 2024-ben Bangkokban a Budapestről elnevezett sétányon avattak emlékművet tiszteletére.
