1937. július 12-én született Budapesten, a Józsefvárosban, a Teleki tér környékén nőtt fel. A kezdetektől vonzotta a színház és a tánc, kisgyermekként több balett- és operaelőadást látott az Erkel Színházban, a Bahcsiszeráji szökőkút című balettet tucatnyi alkalommal nézte meg.
Papírhulladékkal kereskedő szüleinek üzlete tönkrement, ezért 14 évesen dolgozni kezdett, hogy a családon segítsen. Népi táncos volt a SZOT Művészegyüttesben, amikor jelentkezett a Színház- és Filmművészeti Főiskolára, és nyomban felvették, méghozzá érettségi nélkül. Az ő korosztálya volt az utolsó, amely megkapta ezt a lehetőséget: papír nem kellett, elég volt a tehetség.
Tanára volt Gellért Endre, Básti Lajos, Várkonyi Zoltán, osztálytársa Törőcsik Mari, Bodrogi Gyula, Fülöp Zsigmond, Fonyó József. Már másodéves főiskolás korában játszott a Nemzeti Színházban, 1958-as vizsgaelőadásukat, Brecht Koldusoperáját az évad színházi revelációjaként értékelték. Diplomájának kézhezvétele után 1962-ig a Pécsi Nemzeti Színház tagja volt, majd egy-egy évadot a kecskeméti Katona József Színházban és a veszprémi Petőfi Színházban töltött, 1965-től három éven át a Miskolci Nemzeti Színházban játszott. 1968-tól a Mikroszkóp Színpad, 1970-től a Szegedi Nemzeti Színház, 1972-től a budapesti József Attila Színház, 1978 és 1982 között a szolnoki Szigligeti Színház tagja volt.
Itt Paál István rendezővel dolgozott, jelentős szerepeket játszott például a Tangó, a Nem félünk a farkastól és a Koldusopera című darabban. 1982-ben a Magyar Filmgyártó Vállalat (Mafilm), 1990-ben újra a Miskolci Nemzeti Színház társulatának tagja lett. 1999-től a Győri Nemzeti Színház foglalkoztatta, majd szabadúszóként dolgozott. 2001-től tíz éven át a tatabányai Jászai Mari Színház vezető színésze volt.
Utolsó éveiben a Belvárosi Színházban, a Karinthy Színházban, a Rózsavölgyi Szalonban és a Szentendrei Teátrumban is színpadra lépett. 1992 és 1996 között a Magyar Színészkamara ügyvivőjeként is tevékenykedett. Pályája során több mint 140 bemutató részese lehetett, energikus, színes egyénisége, jellegzetes, érdes hangja vígjátéki és drámai szerepekben is kiválóan érvényesült.
Életművében megtalálható a Pygmalion Elizája, Anna Frank, a Ványa bácsi Szonyája és Stuart Mária. A Koldusopera minden női főszerepét eljátszotta, kétszer volt Kocsma Jenny, egy alkalommal Polly, két másik rendezésben pedig Peacockné. Az első magyar musicalben, az Egy szerelem három éjszakája című darabban ő volt az első Júlia, eljátszotta Füst Milán Máli nénijének, a Shirley Valentine és a Hello Dolly! címszerepét, Arkagyinát a Sirályból, Gertrudot a Hamletből, Kurázsi mamát, Phaedrát, Médeiát, Lady Milfordot az Ármány és szerelemből.
A Kamondi Zoltán rendezte miskolci Salome című darabban megkapta a legjobb női alakítás díját az 1995-ös Országos Színházi Találkozón; a Tizenkét dühös ember „női változatában" az egyik esküdtként láthatta a közönség Győrben. 2001-ben rendezőként is bemutatkozott Neil LaBute Szentek fecsegése című darabjának színre vitelével. „Sajnálom, hogy nem folytattam, de a lelkem mélyén úgy érzem, hogy ahhoz még sokkal kreatívabbnak kellett volna lennem. Egy kicsit értek talán a dramaturgiához és a színészvezetéshez. A saját mércém szerint azonban ennél sokkal többre van szüksége a jó rendezőnek” – mondta 2012-ben.
Számos filmben kapott szerepet, többek között a Szevasz, Vera! (1967), a Sárika, drágám (1971), a Tűzoltó utca 25. (1973), a Ballagó idő (1976) című alkotásokban. Dolgozott többek közt Mészáros Mártával (Napló gyermekeimnek), Simó Sándorral (Franciska vasárnapjai), Zsombolyai Jánossal (Vámmentes házasság), András Ferenccel (Végkiárusítás), Böszörményi Gézával (Szívzűr), Radványi Gézával (Circus Maximus), Sándor Pállal (Herkulesfürdői emlék, Ripacsok, Szabadíts meg a gonosztól, Szerencsés Dániel), Gazdag Gyulával (Elveszett illúziók), Alföldi Róberttel (Nyugalom), Kocsis Ágnessel (Pál Adrienn). Utoljára Török Ferenc Senki szigete című alkotásában állt a kamera elé, halála évében.
Szerette az alternatív, kísérletező színházcsinálást, de bárhol otthon tudott lenni, akár nagy múltú kőszínházról, akár alkalmilag összeverbuvált csapatról volt szó. Mindig nyitott tudott maradni, azt vallotta: „Ez egy olyan pálya, ahol mindig figyelni kell, mert minden változik. És ha nem figyelsz, lemaradsz.” Akkor sem esett kétségbe, ha kevesebb színészi feladata volt. Felnőtt fejjel kezdett el nyelveket tanulni, mondván, hogy így könnyebben hódolhat kedvenc hobbijának, az utazásnak. A „mi a célja?" kérdésre egy interjúban így válaszolt: emberséget adni. Úgy tartotta, hogy a sok munkán és tehetségen kívül véletlen és szerencse is kell a színészi pályához.
Művészete elismeréseként 1962-ben Jászai Mari-díjjal jutalmazták. 1981-ben lett érdemes művész, 1989-ben kiváló művész, 1995-ben pedig Déryné-díjat kapott. 2006-ban lett a Halhatatlanok Társulatának örökös tagja. 2010-ben több mint negyvenéves, sokoldalú művészi pályája elismeréseként Kossuth-díjjal tüntették ki.
Margitai Ági rövid, súlyos betegséget követően 2014. november 4-én halt meg Budapesten. Tiszteletére 2017-ben emléktáblát avattak szülőházán, Budapesten, a VIII. kerületi Teleki téren. Egykori színházában, a tatabányai Jászai Mari Színházban bérletsorozatot neveztek el róla.
