Bár a Sixtus-kápolna a Vatikán egyik leghíresebb épülete, felépítésének idejéről és építtetőjének kilétéről pusztán csak hipotéziseket tudtak felállítani a tudósok. Az eredetileg Cappella Magnaként, azaz Nagy kápolnaként ismert (néhol Cappella Maiorként és Cappella Domini Papeként is hivatkozott) szentélyt a legvalószínűbb elméletek szerint III. Ince pápa pontifikátusa (1198–1216) alatt emelték, a 12. század végén vagy a 13. század elején.
Ennek az épületnek a maradványaira épült a ma ismert kápolna, a munkálatokat IV. Szixtusz 1471 és 1484 között tartó pápasága alatt kezdték meg, az egyházfő utasítására, mellyel Baccio Pontelli és Giovannino de ’Dolci építészeket bízták meg. Az eredeti Cappella Magna lebontása feltételezhetően 1475-ben kezdődött, rá egy évre pedig már az új szentélyt is elkezdték felépíteni. Oldalfalain Botticelli, Perugino, Rosselli és Ghirlandaio művei kaptak helyet.
A több mint negyven méter hosszú, 13 méter széles és több mint húsz méter magas kegyhely legfőbb nevezetességei a boltozatot díszítő freskók, melyek 1508 és 1512 között keletkeztek a korszak legnagyobb képzőművésze, Michelangelo kezei által. A II. Gyula pápa által megrendelt műveket 1512. november 1-jén, mindenszentek ünnepén mutatták be. Az összesen 460 négyzetméternyi felületen látható monumentális műnek gyorsan híre ment, azóta is a művészettörténet egyik legfontosabb alkotásaként tartjuk számon.
Érdekesség, hogy Michelangelo eredetileg nem szerette volna elvállalni megbízatást. Néhány évvel korábban ugyanis felemás szájízzel hagyta el a művész Rómát az egyházfő miatt: II. Gyula 1505-ben bízta meg őt azzal, hogy készítse el a pápai síremlékét, pénzügyi forrásaiazonban hamar elapadtak, így Michelangelo nem kapta meg a fizetségét. A Pietà és Dávid szobráról híres képzőművész vonakodva állt a munkához, mondván, hogy ő elsősorban nem festőművész, hanem szobrász. A mennyezeten végül számos bibliai jelenetet örökített meg, köztük Ádám teremtését, de próféták és a pogány hitvilág jósnői, a szibillák is helyet kaptak a festményen.
A Sixtus-kápolna az 1800-as években vált a pápaválasztó konklávé helyszínévé, a tanácskozás idejére pedig csak a bíborosi testület tagjai számára nyitott a szentély. A konklávé fontos kelléke a kegyhely kályhája, mely a főbejáratnál áll – a szavazócédulák elégetésével ad hírt a testület arról, sikeres volt-e az új pápa kilétéről indított szavazás. Mivel a kápolna kéményéből felszálló fekete és fehér füst színét sokszor nehezen lehetett megkülönböztetni, ezért vezették be azt a gyakorlatot, hogy a sikeres választást jelző fehér füst mellett a Szent Péter-bazilika harangjai is hírt adnak arról, hogy megszületett a döntés.
A bíborosok gyűlése április 28-án határozta meg az új pápát megválasztó konklávé kezdetét, mely május 7. lesz. A Sixtus-kápolna már április 28-tól zárva tart a látogatók számára, mivel a tanácskozás megkezdéséig előkészületeket végeznek az épületben. A pápai szertartásmester a konklávé kezdőnapján az „Extra omnes” („Mindenki távozzon!”) latin formulával zárja le a kápolnát, ekkor mindenkinek el kell hagynia a szentélyt, aki nem rendelkezik szavazati joggal.
